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Die Helleborus-Schwarzfleckenkrankheit
 
Text & Fotos: Julia Meiners und Traud Winkelmann

Die Schwarzfleckenkrankheit ist eine sehr bedeutende Krankheit an Helleborus, die den Zierwert der Pflanze drastisch reduziert. Sie wird durch einen pilzlichen Schaderreger (bisheriger wissenschaftlicher Name: Coniothyrium hellebori) hervorgerufen und wurde bereits an verschiedenen Helleborus-Arten und sowohl in Europa als auch in Nordamerika beschrieben (Pape, 1928). C. hellebori verursacht insbesondere am Endstandort starke Schäden. Die Symptome sind 1 bis 3 cm große, unregelmäßig runde, dunkelbraune bis schwarze Flecken, die an Blüten, Stängeln, Blatträndern und in der Blattmitte auftreten können und z.T. ineinanderfließen, wodurch größere abgestorbene Bereiche entstehen (Abb. 1). Sie treten zuerst im frühen Frühjahr auf und verbreiten sich im Jahresverlauf. Ist der Befall sehr stark, treten ein Vergilben und vorzeitiges Absterben der Blätter ein. Die einzige effektive Maßnahme zur Bekämpfung ist das unmittelbare Entfernen von Blattmaterial, um eine erneute Infektion im Folgejahr zu verhindern. Resistente Helleborus wären eine interessante Möglichkeit, um das Krankheitsvorkommen zu reduzieren. Um resistente Helleborus zu entwickeln, sind detailliertes Wissen über den Krankheitserreger und die Charakterisierung des Pflanzenmaterials im Hinblick auf seine Resistenzeigenschaften notwendig.


Abb. 1 - Typische Blattflecken

Aufbau einer Isolatsammlung

Zur Gewinnung von Kenntnissen über die Schwarzfleckenkrankheit wurde befallenes Blattmaterial an 25 verschiedenen Standorten vornehmlich in Deutschland, aber auch in England, Österreich, der Schweiz, den USA und Kanada gesammelt (Meiners und Winkelmann 2011). Die Betrachtung verschiedener Herkünfte diente dazu, mehr über die Variabilität des Erregers herauszufinden und Gemeinsamkeiten und Unterschiede zwischen ihnen zu bestimmen. In den meisten Fällen waren H. niger und H. × hybridus die Wirtspflanzen. Die Variabilität des Pilzes innerhalb von Herkünften und zwischen ihnen ist von entscheidender Bedeutung für die Entwicklung eines Resistenztests an der Pflanze. Für jede Herkunft wurden ausgehend von den Blättern sterile Kulturen auf einem Nährmedium im Labor etabliert. Dies geschah zunächst von den sogenannten Pyknidien (sporentragende Fruchtkörper), die mithilfe eines Mikroskops in den schwarzen Flecken an den Blättern zu erkennen sind (Abb. 2). Sie sind Träger der Sporen (Abb. 3), über die die Krankheit verbreitet wird. Oft waren die daraus auf dem Nährmedium wachsenden Kolonien mit Bakterien oder anderen Pilzen verunreinigt. Deshalb wurden im Anschluss Kulturen aus einzeln isolierten Sporen, die je nach Herkunft 4,1 bis 5,1 μm lang und 2,6 bis 3,0 μm breit waren, gewonnen. Diese Einsporlinien waren die Grundlage für die weiteren morphologischen und molekulargenetischen Untersuchungen.


Abb. 2 - Blattrandnekrose mit konzentrischen Kreisen und Pyknidien (schwarze Punkte) im abgestorbenen grauen Bereich.



Abb. 3 - Sporen des Erregers der Schwarzfleckenkrankheit

Morphologie und Pathogenität der verschiedenen Herkünfte

Zunächst wurde ein Experiment zum Vergleich des Myzelwachstums nach Herkünften und zur Ermittlung ihrer optimalen Wachstumsbedingungen bei Temperaturen von 5, 10, 15, 20, 25 und 30 °C auf Tomatenpüree-Agar durchgeführt. Die optimale Temperatur ist für Resistenztests an Pflanzenmaterial wichtig, damit der Erreger gute Entwicklungsbedingungen vorfindet. Ein optimales Myzelwachstum wurde bei einer Temperatur von 20 °C erreicht (Abb. 5) und es schwankte zwischen den Herkünften von 2,4 bis 3,4 mm/24 h. Große Wachstumsunterschiede zwischen den Herkünften waren bei 25 °C zu verzeichnen. Bei 30 °C fand nahezu kein Wachstum mehr statt. Die Farbe des Myzels variierte von Weiß bis Dunkelgrau. Zur Produktion von großen Sporenmengen, die zur Inokulation von Pflanzenmaterial verwendet werden sollten, eignete sich Haferflockenagar am besten. Auf diesem Nährmedium bildeten alle Herkünfte Sporen in größeren Mengen als auf Tomatenpüree-Agar (Abb. 4). Des Weiteren war eine Kultur bei Dunkelheit besser zur Gewinnung von Sporen geeignet als eine bei Licht.
Um sicherzugehen, dass die Symptome der Wirtspflanze tatsächlich auch durch den isolierten Pilz verursacht wurden, wurden je drei H. niger- Jungpflanzen in Töpfen nach Herkünften getrennt voneinander mit einer Sporensuspension beimpft und unter kontrollierten Bedingungen kultiviert. Nach 35 Tagen wurde die Ausprägung der Krankheit anhand der Symptomakkumulation bewertet. Symptome waren kleine schwarze Nekrosen, Absterben des jüngsten Blattes, Läsionen (>0,5 cm²) und Absterben der inokulierten Blätter. Die Symptome waren unterschiedlich stark ausgeprägt, aber es wurden keine Unterschiede zwischen den Herkünften hinsichtlich ihrer Virulenz und Symptomentwicklung sowie -ausprägung festgestellt. Alle Herkünfte waren in der Lage, die Pflanzen zu infizieren, sodass damit der Nachweis erbracht wurde, dass die untersuchten Pilzisolate auch die Erreger der Krankheit waren und die Koch’schen Postulate somit erfüllt waren.


Abb. 4 - Vergleich der Sporenproduktion auf Tomatenpüree-Agar und Haferflockenagar bei 20 Grad C mit unterschiedlicher Belichtung



Abb. 5 - Myzelwachstum auf Tomatenpüree-Agar bei unterschiedlichen Temperaturen

Molekulargenetische Untersuchungen

Nach Abschluss der morphologischen Untersuchungen wurde die Variabilität der Herkünfte auf genetischer Ebene mittels molekularer RAPDMarker (random amplified polymorphic DNA) bestimmt. Insgesamt produzierten 37 RAPD-Primer 394 DNA-Fragmente. Auf Basis von gemeinsamen und unterschiedlichen DNA-Fragmenten wurde mithilfe eines statistischen Verfahrens namens UPGMA (unweighted pair group method with arithmetic mean) ein Phenogramm erstellt, das die Verwandtschaft der Herkünfte visualisierte (Meiners und Winkelmann 2011). Bei der UPGMA-Analyse wurden die Isolate in zwei Gruppen eingeteilt, die nicht nach geografischen oder morphologischen Kriterien geordnet waren, wohl aber nach der Wirtspflanze, von der die Isolate stammten (H. niger bzw. H. × hybridus). Das warf die Frage auf, ob es sich möglicherweise um mehrere Arten oder Unterarten des Pilzes handelt. Um diese Hypothese zu prüfen, wurden die Sequenzen charakteristischer DNA-Abschnitte ribosomaler Gene (ITS = internal transcribed spacer und LSU = large subunit rRNA) ausgewählter Herkünfte beider Gruppen ermittelt. Vergleiche der erhaltenen DNA-Sequenzen verschiedener Herkünfte haben ergeben, dass keine Sequenzunterschiede zwischen den Herkünften der beiden Gruppen vorlagen, es sich also somit um nur eine Art des Erregers handelte.
Anschließend wurde die Sequenz mit denen anderer Pilze in einer Datenbank verglichen. Dabei stellte sich heraus, dass die genetische Ähnlichkeit zu Pilzen der Gattungen Phoma und Microsphaeropsis größer als zur Gattung Coniothyrium war. Damit gehört der Pilz zur Familie der Didymellaceae, die erst kürzlich beschrieben wurde (de Gruyter et al. 2009), und muss systematisch neu eingeordnet werden. Dafür sind morphologische und weitere Vergleiche von DNA-Abschnitten notwendig.
Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass jetzt Informationen zur Kultur des Pilzes in vitro und zur Sporenproduktion vorliegen, die wichtig für die Bereitstellung von Material für Resistenztests sind. Sowohl die morphologischen als auch die molekulargenetischen Untersuchungen zeigten eine geringe Variabilität des Erregers, die mit der vorrangigen, wenn nicht ausschließlichen vegetativen Vermehrung zu erklären ist. Weitere Untersuchungen sind notwendig, um die taxonomische Stellung des Erregers zu klären. Die Basis für die Durchführung von Resistenztests ist gelegt, mit denen nun in der Gattung Helleborus nach Resistenzquellen gesucht werden kann.

Danksagung

Die Förderung des Vorhabens erfolgte aus Mitteln des Bundesministeriums für Ernährung, Landwirtschaft und Verbraucherschutz (BMELV) über die Bundesanstalt für Landwirtschaft und Ernährung (BLE) im Rahmen des Programms zur Innovationsförderung. Des Weiteren danken die Autoren der Firma Heuger, Glandorf, für das zur Verfügung gestellte Pflanzenmaterial und ihr Dank gilt den Sammlern von Isolaten.

Literatur
de Gruyter, J., Aveskamp, M.M., Woudenberg, J.H.C., Verkley, G.J.M., Groenewald, J.Z., Crous P.W. (2009): Molecular phylogeny of Phoma and allied anamorph genera: towards a reclassification of the Phoma complex. Mycological Research 113: 508–519.

Meiners, J., Winkelmann, T. (2011): Morphological and genetic analyses of hellebore leaf spot disease isolates (Coniothyrium hellebori) from different geographic origins show low variability and reveal molecular evidence for reclassification into Didymellaceae. Journal of Phytopathology 159: 665-675.

Pape, H., (1928): Eine häufige pilzparasitäre Blattfleckenkrankheit der Christrose. Gartenwelt 32:9-10.

 
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